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2、园区 (72)发明人 王革 (54) 发明名称 用基因工程技术制备唾液酸 (57) 摘要 本发明公开了一种基因工程制备唾液酸的方 法。采用重组酶法生产唾液酸的生产工艺， 即通 过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶 一异构化酶和唾液酸醛缩酶构建在同一表达质粒 中， 转化入同一大肠杆菌宿主菌内， 通过发酵表达 两个重组酶， 离心收集菌体， 将菌体固定化， 用固 定化菌体中的多重组酶来催化葡萄糖胺和丙酮酸 完成合成反应， 得到唾液酸。 检测方法是用酸水解 方法将结合状态的唾液酸变成游离状态， 游离状 态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物， 再 用有机酸萃取后， 测定唾液酸含量。 采用本发明作。
3、 为唾液酸的生产和检测方法， 大大简化了流程和 降低了成本， 能使生产效率显著提高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种用基因工程技术制备唾液酸的方法， 其关键技术在于构建筛选唾液酸基因工程 菌株， 具体为通过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶一异构化酶和唾液酸醛缩 酶构建在同一表达质粒中， 转化入同一大肠杆菌宿主菌内， 再进行菌种筛选得到基因工程 菌， 用于唾液酸制备。 2. 用基因工程技术制备唾液酸的工艺， 其特征在于经过 ： 工程菌种构。
4、建种子液制备 发酵和诱导表达离心菌体收集洗涤菌体多催化酶体的固定化催化葡萄糖胺和 丙酮酸在合适条件下生成唾液酸提纯、 冷冻干燥唾液酸纯品产品质量检测等步骤完 成。 3. 如权利 2 所述产品检测， 本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态， 游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物， 再用有机酸萃取后， 测定唾液酸含量。 权 利 要 求 书 CN 102649965 A 2 1/2 页 3 用基因工程技术制备唾液酸 0001 本发明涉及基因工程技术制备唾液酸， 具体为用唾液酸的重组酶法生产工艺， 利 用多酶工程菌技术和多酶一步催化技术来生产唾液酸。 0002 唾液酸 (Sialic。
5、 Acid) 是神经氨酸衍生物的通用名， 学名叫作 “N- 乙酰基神经 酸” ， 是一种天然存在的碳水化合物， 通常以低聚糖， 糖脂或者糖蛋白的形式存在。 唾液酸及 以唾液酸为母体的药物在国外已应用于临床， 其最重要的生理作用是 ： (1) 用于抑制流感 及其它的传染性病毒。 (2)可用于神经性疾病、 炎症、 肿瘤。 (3)可用于治疗Alzheimer型老 年痴呆症。唾液酸具有抗病毒及抗细菌感染、 提高免疫力、 中和毒素及抗炎、 保护呼吸系统 的功能， 是燕窝的主要成分， 在国外已开发成为预防治疗呼吸道病毒感染和流感的新型药 物， 因此唾液酸及其衍生物非常有潜力成为预防和治疗传染性病毒的新型药。
6、物， 并象阿斯 匹林、 青霉素等普药一样生命力长久不衰。据报道， 唾液酸的国内外市场年需求量超过 100 吨， 近期全球市场份额在 5 亿元人民币以上。目前该产品国外已广泛应用， 国内处于起步阶 段， 有着远大的市场前景和巨大的市场潜力， 经济效益和社会效益显著。 0003 本发明成功构建了高效制备唾液酸的工程菌株， 发明了重组酶法生产工艺。此方 法大大简化了生产工艺流程， 降低了生产成本， 有利于进行产业化放大生产。同时， 利用固 定化多酶工程菌技术为基础， 以唾液酸为原料生产唾液酸系列衍生物的技术已经在实验室 规模上得到实现。 该创新技术还为以后继续开发唾液酸系列衍生物新产品和扩大唾液酸在。
7、 生物技术领域的应用提供技术支持和建立技术平台。 本发明采用酸水解方法将结合状态的 唾液酸变成游离状态， 游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物， 再用有机酸萃 取后， 测定唾液酸含量。 0004 本发明的原理 ： 通过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶一异构化酶和 唾液酸醛缩酶构建在同一表达质粒中， 转化入同一大肠杆菌宿主菌内， 通过发酵表达两个 重组酶， 离心收集菌体， 将菌体固定化， 用固定化菌体中的多重组酶来催化葡萄糖胺和丙酮 酸完成合成反应， 得到唾液酸。 0005 本发明的目的 ： 我们发明的唾液酸重组酶法生产工艺， 大大简化了生产工艺流程， 降低了生产成本， 有利于进。
8、行产业化放大生产。唾液酸的生产方法有天然提取法、 发酵法、 化学合成法(含酶促合成法)。 但由于天然提取法、 发酵法成本高， 收率低， 难以大规模产业 化。 目前国际上主要采用化学酶促合成法生产唾液酸， 但步骤烦琐， 纯化困难， 产率低， 原材 料消耗大， 尤其是使用的唾液酸醛缩酶需购买但价格昂贵， 致使生产成本居高不下。 0006 技术方案 ： 工程菌种构建种子液制备发酵和诱导表达离心菌体收集洗涤 菌体多催化酶体的固定化催化葡萄糖胺和丙酮酸在合适条件下生成唾液酸提纯、 冷 冻干燥唾液酸纯品产品质量检测 0007 最佳实施例 ： 1、 发酵工艺 ： 从培养基的组成、 PH 值的影响、 搅拌转速。
9、和培养时间四 个方面对唾液酸基因工程菌培养条件进行了研究。 通过对唾液酸基因工程菌培养条件的研 究筛选， 确定山梨醇为最佳碳源， 氯化铵作无机氮源， 再进行培养条件的正交实验， 获得最 佳培养基为 ： 山梨醇 2.5， 氯化铵 0.5， 磷酸氢二钾 90mmol/L， 胰蛋白胨 1.5， 硫酸镁 0.04， PH 7.8。通过研究不同 PH 值对唾液酸基因工程菌发酵过程中菌体生长和产唾液酸 说 明 书 CN 102649965 A 3 2/2 页 4 的影响得出， 发酵初期 PH 自然下降时有利于菌体生长， 菌体生长对数期较长， 最大菌体干 重可达 6.9g/L ； 发酵中后期 PH 控制在 。
10、6.4 时有利于唾液酸的延续合成。通过比较不同搅 拌转速对菌体分批发酵生产唾液酸过程的影响， 根据发酵前、 后期菌体细胞比生长速率和 唾液酸比合成速率达到最大值所需搅拌转速的不同， 提出了两阶段搅拌转速控制策略 ： 发 酵前期 (0-5h) 控制搅拌转速 500r/min， 发酵中后期控制搅拌转速 700r/min。通过对产唾 液酸菌株大肠杆菌培养时间进行研究得出 ： 在 250ml 的摇瓶中， 装液量为 40ml， 起始 PH 值 为7.8， 转速250r/min， 37恒温培养5h， 其唾液酸产量可达1001ug/mL ； 而如果培养时间延 长至 6.5h， 可使唾液酸的产量提高到 150。
11、0ug/mL。 0008 2. 提取工艺 ： 从洗脱剂种类、 洗脱剂浓度、 上柱液浓度、 上柱流量、 起始 PH 等方面 对唾液酸的提取工艺进行了研究。通过对不同洗脱剂对工艺影响的研究对比， 确定 NaCl 为 最佳洗脱剂， 并在 NaCl 系列浓度下进行洗脱发现， 在浓度为 0.15M 时得到比较好的提取结 果。通过运用不同上柱清液浓度、 不同上柱流量和不同洗脱流速， 在用 0.15MNaCl 洗脱条件 下， 对获得的结果进行比较， 得出最佳的工艺为上柱清液浓度 8000ug/mL， 上柱流量 (Sv) 为 0.6( 柱体积 / 小时 )， 洗脱流速为 1.0( 柱体积 / 小时 )。通过比。
12、较不同上柱起始 PH 对纯化 的影响， 得出在 PH4.5 时能够获得最好的结果。综合上述得出在上柱清液浓度 8000ug/mL， 上柱流量 (Sv) 为 0.6( 柱体积 / 小时 )， 上柱起始 PH4.5， 洗脱流速为 1.0( 柱体积 / 小时 )， 用NaCl为洗脱剂且浓度在0.15M的条件下能得到比较好的洗脱效果， 获得的唾液酸性质稳 定， 纯度在 95以上。 0009 测定方法 ： 本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态， 游离状态的 唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物， 再用有机酸萃取后， 测定唾液酸含量。 0010 唾液酸对照品溶液 (200g/m1) 的制备精密称。
13、取唾液酸对照品 10.52mg(1g 唾 液酸相当于 3.24nmol)， 置 10ml 量瓶中， 加水溶解并稀释至刻度， 混匀， 即为唾液酸贮备液 (1mg/ml)， 按一次使用量分装， -70贮存， 有效期 1 年。仅可冻融 1 次。4保存使用期为 2 周。精密量取唾液酸贮备液 1ml， 置 5ml 量瓶中， 加水至刻度， 即为每 1ml 含 200g 的唾 液酸对照品溶液， 用前配制。 0011 测定法 ： 取供试品适量， 加水稀释至蛋白浓度约为每 1ml 含 0.2 0.4mg， 作为 供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、 水及供试品溶液于 10ml 玻璃试管中， 混匀， 每 管再加。
14、入间苯二酚 - 盐酸溶液 ( 分别量取 2间苯二酚溶液 2.5ml、 0.1mol/L 硫酸铜溶液 62.5l、 25盐酸溶液 20ml， 加水稀释至 25ml， 混匀。试验前 4 小时内配制 )1ml， 加盖， 沸 水煮沸 30 分钟 ( 水浴面高于液面约 2cm)， 取出置冰浴中 3 分钟 ( 同时振摇 ) 后， 每管加乙 酸丁酯 - 丁醇液 ( 取乙酸丁酯 4 份与丁醇 1 份混匀， 室温下保存， 12 小时内使用 )2ml， 充分 混匀， 室温放置 10 分钟， 按紫外 - 可见分光光度法， 在波长 580nm 处测定吸光度。 0012 本发明的优点 ： 本发明采用了具有自主知识产权的 “重组酶法工艺” ， 利用重组多 酶工程菌和重组多酶一步催化技术来生产唾液酸。与其他生产方法相比， 本发明具有以下 优势 ： 1. 本发明采用重组酶法生产工艺， 工艺简化， 有利于进行产业化生产。其他方法采用 化学合成工艺， 工艺复杂 ； 2. 本发明中催化剂来源是自行发酵生产重组酶， 其他方法是购 进商品酶 ； 3.在纯度上本发明产品达到99， 而其他方法97； 4.产品成本上， 本发明 产品成本较其他方法成本明显降低。 说 明 书 CN 102649965 A 4 。
